Новые вопросы
 Сетчатка и невроз
(Вопрос задал: Кирилл)

 Шприцы для инъекций
(Вопрос задал: Николай)

 Диагноз глаукома и катаракта
(Вопрос задал: Инна)

 теряет глаз
(Вопрос задал: Ангелина Владимировна Белашова)

 повернит зир
(Вопрос задал: саня)


Видео

Амниотическая мембрана, как субстрат культивирования стволовых клеток

10-01-2011, 17:34
Амниотическая мембрана, как субстрат культивирования стволовых клеток
Актуальность вопроса
Лечение заболеваний и повреждений глаза, при которых имеется выраженная несостоятельность процессов регенерации, остается актуальной проблемой офтальмологии, так как зачастую приводит к значительному снижению остроты зрения и слепоте.

Для реконструкции поверхности переднего отрезка глаза применяют: лечебные мягкие контактные линзы, адгезивные вещества и клеи, аутоконъюнктивальную пластику и трансплантацию аутослизистой ротовой полости, а также трансплантацию донорской роговицы и конъюнктивы, амниотической мембраны, лимбальных ауто-и аллографтов.

В последние годы в литературе рассматривают трансплантацию культивированных стволовых клеток как наиболее перспективный метод, позволяющий влиять на ход репарации тканей организма человека. Современные клеточные биотехнологии успешно применяются в общей комбустиологии, эндокринологии и хирургии. В настоящее время исследования ученых направлены на выяснение тонких механизмов регуляции процессов дифференцировки стволовых клеток после трансплантации их на поверхность глаза.

После подтверждения эффективности и безопасности нового метода лечения станет возможным его применение у пациентов с тяжелыми заболеваниями и повреждениями глаз, ранее неизбежно приводивших к значительному снижению зрения и слепоте.
Особенности регенерации эпителиального покрова поверхности глаза
В нормальных условиях поверхность глаза покрыта роговичным, лимбальным и конъюнктивальным эпителием. Роговичный эпителий обладает рядом специфических свойств, которые отличают его от других типов покровного эпителия. Роговичные эпителиальные базальные клетки являются относительно более зрелыми по сравнению с таковыми у других эпителиальных тканей. Клетки роговичного эпителия обладают выраженной способностью к центрипетальной миграции. Роговичный эпителий практически никогда не является источником опухолей. Возникновение опухолей в периферических отделах роговицы связывают с зоной лимба, особенно с пигментсодержащими клетками.

Поддержание постоянства любой эпителиальной структуры обеспечивается популяцией стволовых клеток (СК), которые представляют собой уникальный источник регенерации клеток, как в физиологических условиях, так и при заболеваниях или травмах. СК определяются по их способности к неограниченному и продолжительному размножению, в результате которого возникает, по крайней мере, один тип высоко дифференцированных клеток. Стволовые конъюнктивальные клетки расположены в основном в области сводов. В 1971г M.Davanger и A.Evansen предположили, что лимбальный эпителий является источником стволовых клеток для роговицы, что в последующем было подтверждено многими учеными в эксперименте и клинике (Sun T-T., 1977; Schermer A., 1986; Thoft R.A. et al, 1989; Pellegrini G. et al, 1999). Существует также промежуточная популяция клеток-родоначальников, называемых транзиторными амплифицирующими клетками (TA-клетки), которые расположены в базальном слое эпителия роговицы и имеют относительно ограниченную пролиферативную активность. Все супрабазальные клетки эпителия являются высоко дифференцированными и, соответственно, не способны к размножению (A.J.W. Huang, S.C.G. Tseng, 1991).

Известно, что роговичный эпителий обладает большими способностями к регенерации. В физиологических условиях происходит достаточно быстрое отмирание поверхностных слоев центральной зоны роговицы. Регенерация роговичного эпителия обеспечивается размножением базальных эпителиальных клеток и их постепенным перемещением в супрабазальные слои. А также делением лимбальных СК и последовательной центрипетальной миграцией от периферии роговицы.

Фенотип СК контролируется как внутренними, так и внешними факторами, причем последние определяются микросредой, или так называемой нишей СК (Watt F.M., Hogan B.L, 1993). Под которой понимают контактирование с окружающими клетками и взаимодействие с экстрацеллюлярным матриксом и факторами роста.

Предполагается, что подобно СК гематопоэтического ряда, эпидермальному и кишечному эпителию, лимбальные СК относятся к долгоживущим клеткам с медленным клеточным циклом, низкой митотической активностью и устойчиво низкой степенью дифференцировки. Однако, они могут активироваться при возникновении потребности в регенерации посредством увеличения их собственной популяции в процессе размножения и/или дифференцировки в ТА-клетки.

В противоположность СК, ТА-клетки относятся к короткоживущим клеткам с быстрым клеточным циклом, которые способны за счет этих качеств эффективно увеличить количество эпителиальных клеток при ограниченном количестве митозов (Lehrer M.S. et al, 1998).

Лимбальные СК и/или стромальная микросреда, в которой они находятся, могут повреждаться значительным количеством факторов, вызывая клиническую картину, называемую синдромом лимбальной недостаточности (см. таблица 1). Он включает в себя следующие признаки: наличие конъюнктивального паннуса, хроническое воспаление, помутнение роговицы различной степени выраженности, неоваскуляризация, плохое взаимодействие эпителиальнах клеток, которое проявляется неровностью поверхности, рецидивирующими эрозиями и язвами, деструкцией базальной мембраны. По степени выраженности выделяют частичную и тотальную лимбальную недостаточность (S.С.G. Tseng, 1995). По патогенезу синдром лимбальной недостаточности (СЛН) может быть разделен на 2 большие группы:

1. СЛН, вызванный первичной деструкцией лимбальных стволовых клеток

2. СЛН, вызванный первичной деструкцией лимбальной стромы

Таким образом, для успешного лечения заболеваний, протекающих с синдромом лимбальной недостаточности, необходим дифференцированный подход, учитывающий тип и степень его выраженности. В настоящее время существует ряд методов, способствующих поддержанию популяции СК:

• трансплантация амниотической мембраны,

• аутолимбальная трансплантация (пересадка участка лимба, взятого с контрлатерального глаза при одностороннем поражении),

• аллолимбальная трансплантация (пересадка участка лимба, взятого у доноров),

• пересадка культивированных ex vivo стволовых эпителиальных клеток.

Впервые способ лечения СЛН путем трансплантации амниотической мембраны (АМ) был предложен S.C.G. Tseng et coll. D 1997 г. В настоящее время известна его эффективность при частичной лимбальной недостаточности, что объясняется противовоспалительным и антиапоптотическим эффектом базальной мембраны амниона, а также наличием значительного количества факторов роста и других биологически активных веществ в его строме и эпителии, что способствует восстановлению поврежденной стромы лимба.

В случае тотальной лимбальной недостаточности необходима пересадка ауто-либо аллогенных лимбальных стволовых клеток. Этот метод был впервые предложен Kenyon and Tseng в 1989г. В последствии его эффективность в лечении частичного либо тотального одностороннего СЛН, вызванного различными заболеваниями, была подтверждена другими исследователями. Донорский материал может быть взят со здорового контрлатерального глаза (лимбальный аутографт), либо от донора-родственника (лимбальный аллографт), либо это может быть кадаверный кератолимбальный аллографт. Однако, несмотря на полученные отдельными авторами обнадеживающие результаты лечения СЛН, были выявлены следующие недостатки. Во-первых, при использовании в качестве донора собственного контрлатерального глаза пациента либо зрячего глаза родственника, существует риск вызвать персистирующее воспаление и помутнение роговицы на глазу донора, что, безусловно, не может удовлетворить ни пациента, ни хирурга. Во-вторых, при использовании кадаверного материала высок риск отторжения трансплантата, кроме того, забор материала и его использование должны осуществляться в ранние сроки после смерти донора, что сопряжено с техническими сложностями.

В последние годы офтальмологами изучается возможность применения в клинике новой технологии, называемой культивированием ex vivo эпителиальных стволовых клеток, которая позволяет избежать потенциальных осложнений, связанных с пересадкой лимбального аутографта.

Условия культивирования СК

Экспериментальными исследованиями было доказано, что для длительного культивирования и размножения различных типов эпителиальных клеток необходимо наличие питательной среды либо субстрата, присутствие фибробластов, а также достаточное количество факторов роста и цитокинов (Green H., 1979; Rochat, 1994).

Система для культивирования, содержащая фибробласты и сокращенно называемая 3Т3-система, была применена для выращивания эпителиальных клеток поверхности глаза кролика (Sun T-T et al., 1977;) и человека (Pelligrini G., 1999). При изучении клонированных лимбальных эпителиальных клеток было обнаружено, что они успешно консервируются в 3Т3-системе (Lindberg K., 1993). Отсюда родилась идея, что функция СК поддерживается стромальными фибробластами, но до сих пор остается неясной природа такой активности фибробластов.

Методы культивирования стволовых эпителиальных клеток


В настоящее время существуют различные модели культивирования клеток эпителия и СК. Впервые Green and Rheinwald в 1975г. разработали способ получения клеточных культур человеческих кератиноцитов, взятых из эпидермиса, который используется в лечении ожогов кожи и внастоящее время.

В 1982 г. Friend et al. предложили способ культивирования роговичных эпителиальных клеток на базальной мембране, полученной из роговиц кроликов. В дальнейшем изучалась возможность применения других субстратов, таких как гидрогель, покрытый фибронектином, коллагеновые матрицы, фибрин и т.д., для культивирования эпителия ex vivo (Kobayashi, Ikada, 1991; Minami et al.,1993; Rama et al. 2001).

Rama et al. в 2001г использовали фибриновый субстрат для культивирования лимбальных эпителиальных клеток, взятых с контрлатерального здорового глаза. Они трансплантировали полученные клетки и получили хороший результат – эпителизация в течение первой недели. Поскольку фибриновый гель в последствии абсорбируется, возможна трансплантация клеток на субстрате непосредственно на роговицу.

Сегодня для культивирования применяются системы эксплантов, клеточных суспензий, система выращивания многослойных культур эпителиальных клеток в интерфазе вода – воздух. Общие принципы получения культур стволовых клеток, тем не менее, остаются прежними.

1. Получение донорских стволовых клеток.

2. Выбор соответствующего субстрата для культивирования клеток.

3. Получение питательной среды, содержащей эпителиальные клетки.

4. Мониторинг клеточного роста.

5. Изучение характеристик полученной культуры клеток.

Характеристика амниотической мембраны как субстрата для культивирования СК.

В последнее время разными исследователями in vitro и in vivo было продемонстрировано, что амниотическая мембрана (АМ) может быть успешно использована в качестве субстрата для культивирования эпителиальных СК и их последующего применения в лечении тяжелой патологии поверхности глаза, протекающей с СЛН.

АМ – является самой внутренней из плодных оболочек. Она состоит из монослоя эпителиальных клеток, толстой базальной мембраны и аваскулярной стромы. Благодаря содержанию значительного количества цитокинов, факторов роста, металлопротеаз, антимикробных факторов АМ способствует культивированию на своей поверхности эпителиальных клеток. В таблице 2 отражены характеристики АМ и предположительные механизмы ее действия. АМ не содержит антигенов гистосовместимости и не является, таким образом, иммуногенной, поэтому ее применение не требует иммуносуппрессии, которая обычно применяется при трансплантации других тканей.

В настоящее время установлены следующие особенности культивирования СК:


1. Система культивирования «СК на интактной АМ» благоприятствует сохранению свойств и размножению лимбальных СК.

2. При использовании системы культивирования «СК+АМ, лишенная эпителия, в отсуствии 3Т3 фибробластов» получаемые клетки схожи по характеристикам с ТА-клетками роговицы.

3. При использовании системы культивирования «АМ, лишенная эпителия +3Т3 фибробласты» происходит замедление, но не предотвращение дифференцировки лимбального эпителия.

Результаты клинического применения культивированных СК

В настоящее время имеется относительно небольшой клинический опыт применения культивированных СК. Впервые новый метод лечения применили Tsai R. et coll. (2000) у 6 пациентов с односторонним частичным или тотальным СЛН. Они использовали ткань аутолимба, полученную путем биопсии контрлатерального глаза, для последующего культивирования на криоконсервированной интактной АМ и получили успешный результат: увеличение остроты зрения в 83% случаев, в реэпителизация без васкуляризации в 100% (при сроке наблюдения за пациентами в течение 15 месяцев).

Koizumi N. et al. (2001) применили новый способ лечения у 2 пациентов с острым синдромом Стивенса-Джонсона, у которых не удавалось достичь эпителизации при использовании традиционных методов. Они культивировали аллогенную лимбальную ткань, взятую от донорской роговицы, на лишенной эпителия АМ с добавлением 3Т3-фибробластов. Выросший монослой клеток был пересажен в область дефекта поверхности роговицы и конъюнктивы. Была достигнута эпителизация поверхности, в течение последующих 6 месяцев результат оставался стабильным. Затем авторы применили тот же метод при лечении 13 пациентов с тотальным СЛН и периодом наблюдения около 12 месяцев. У 10 из 13 пациентов возник рецидив первичной патологии.

Schwab I.R et coll. (2002) для лечения 14 пациентов использовали ауто-и аллогенные лимбальные эпителиальные клетки, которые выращивались в культуре, содержащей 3Т3 фибробласты, а затем помещались на лишенную эпителия АМ. У 6 из 10 пациентов с аллогенным трансплантатом была достигнута эпителизация поверхности роговицы при сроке наблюдения от 6 до 19 месяцев.

Shimazaki J. et al. (2002) доложили о 13 случаях трансплантации культивированных лимбальных клеток, из которых 7 были аллогенными и 7 были получены от близких родственников. Восстановление поверхности роговицы было достигнуто в 46,2% случаев. В 5 случаях возник рецидив васкуляризации, у 1 пациента на поверхности глаза был зафиксирован рост ороговевающего эпителия, у 1 пациента эпителизации вообще не было достигнуто. У этих авторов успешные результаты при пересадке культивированных клеток сравнимы с их результатами пересадки лимба и трансплантации АМ.

Grueterich M. et al. (2003) выполнили гистологические и иммуногистологические исследования образцов роговицы, полученных по истечении 5 месяцев после успешной трансплантации культивированных лимбальных клеток (на интактной АМ без добавления фибробластов) по поводу тотального СЛН, вызванного химическим ожогом. Результаты показали, что трансплантированная АМ интегрируется в структуру роговицы, эпителиальные клетки имеют фенотип лимбальных эпителиальных клеток, в которых не определяется экспрессии К3-кератина и Сх43-конексина. Эти данные показывают, что стволовые лимбальные клетки, культивированные на интактной АМ могут некоторое время сохранять свои свойства даже в нехарактерной для них микросреде – в центральной зоне роговицы. Поверхность роговицы оставалась прозрачной, аваскулярной, гладкой в течение 21 месяца наблюдения. Таким образом, лимбальные эпителиальные клетки действительно поддерживают свою популяцию на поверхности роговицы.

Nakamura T. et al. (2004) использовали для лечения 4 пациентов с тотальным СЛН культивированные на АМ эпителиальные клетки аутослизистой ротовой полости. У всех пациентов было отмечено уменьшение степени выраженности рубцовых изменений конъюнктивы, уменьшения количества новообразованных сосудов на поверхности роговицы и повышение остроты зрения.

Выводы

Полученные к настоящему времени результаты экспериментальных, лабораторных и клинических исследований убедительно доказывают, что стволовые эпителиальные клетки роговицы и конъюнктивы могут успешно культивироваться in vitro на АМ, которая служит уникальным субстратом, обеспечивающим рост и размножение СК. Эта концепция является основной в новом методе лечения тяжелой патологии поверхности глаза, сопровождающейся синдромом лимбальной недостаточности. В дальнейшем перспективным представляется изучение точной природы тонких взаимодействий между субстратом и растущими на нем СК. Необходимо разработать методику выращивания стабильных клеточных пластов, способных продолжать рост и направленную дифференцировку после трансплантации на поверхность глаза. Поскольку имеются данные о том, что простого удаления эпителия АМ достаточно для запуска дифференцировки стволовых эпителиальных клеток, метод культивирования может помочь в дальнейшем определить, какие гены задействованы в этом процессе, а также выяснить способы управления ими. Необходимо разработать четкие диагностические критерии и показания к использованию метода трансплантации культивированных стволовых и эпителиальных клеток, а также оценить степень его эффективности и безопасности при различных заболеваниях органа зрения.

Обсудить на форуме



 
Просмотров: 5751
 Комментарий #3  | 15 июня 2017 16:51 | Цитировать     
abookz.net


Группа: Гости
Публикаций: 0
Комментариев: 0
Зарегистрирован: --
ICQ: --
, , , , , .
 Комментарий #2  | 8 марта 2014 23:48 | Цитировать     
ViktoriyaCal


Группа: Гости
Публикаций: 0
Комментариев: 0
Зарегистрирован: --
ICQ: --
Кто то недвано интересовался , по поводу лечения в израиле, могу посоветовать http://medicaltour.co.il у меня родственники приезжали на лечение ,организацией остались довольны , кстати , когда речь зашла об оплате мол куда платить - предоставили два варианта либо через фирму , либо в больничную кассу , (оплатили все через больничную кассу ) .
 Комментарий #1  | 7 марта 2014 16:56 | Цитировать     
ElenaCal


Группа: Гости
Публикаций: 0
Комментариев: 0
Зарегистрирован: --
ICQ: --
Кто-нибудь ездил лечится в Израиль? Как вы выбирали клинику и врачей? У мамы подозрение на онкологию, плюс наследственность, поэтому она очень переживает и хотела бы серьезно обследоваться. Друзья рекомендуют этот сайт http://medicaltour.co.il но хотелось бы узнать еще варианты.. Что думаете?
Добавить комментарий
Ваше Имя:  
Ваш E-Mail:  

Код:
Включите эту картинку для отображения кода безопасности
обновить, если не виден код


Введите код: 


Советы офтальмолога:
Уважаемые гости портала!Большинство пациентов, обращающихся к офтальмологу с краснотой глаз, самостоятельно покупают и капают капли, убирающие этот косметический дефект. Эти сосудосуживающие капли нап ...
Все права защищены 2010 | Большой Медицинский Портал
Создание и поддержка сайта: cтудия AlexStudio.org